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淋巴细胞分离液(Lymphocyte Separation Medium 1.084，简称LSM-1.084)是一种无菌的即用型分离液，基于Böyum的Ficoll-甲泛影钠溶液做过一些改良，使得操作简单快速且分离效率更高。本品是无菌的聚蔗糖Ficoll/泛影酸钠混合溶液，密度为1.084g/mL，内毒素含量很低(＜0.12 EU/mL)，是在严格控制的环境下加工生产的，生产条件符合ISO13485:2003标准和GMP认证。相对于密度为1.077g/mL的人淋巴细胞分离液，本品适用于分离更高密度的人单个核细胞，包括外周血，脐带血以及骨髓瘤来源的组织样本。还适用于分离大小鼠血细胞，正因为啮齿动物的淋巴细胞密度稍高于人淋巴细胞。

去纤维蛋白或抗凝人血以1：1的比例用无菌生理盐水或平衡盐溶液稀释，小心的添加在分离液上层(不要混杂在一起)，之后离心30～40min。离心过程中，差速迁移使其最终形成几个不同的细胞分层：
① 聚集在管底的颗粒主要是Ficoll聚集的红细胞以及沉淀物；
② 紧挨着上面一层的颗粒主要是粒细胞，其处于LSM-1.084溶液的渗透压临界，具有足够高的密度迁移穿过LSM-1.084溶液层。
③ 单个核细胞分布在血浆和LSM-1.084分离液的中间层，还包括一些沉降系数低(密度低)的颗粒，如血小板。
淋巴细胞，单核细胞和血小板不具有足够高的密度穿透LSM-1.084分离液层，因此这些细胞在血浆和LSM-1.084分离液层聚集形成一个中间分层。吸取中间层，用平衡盐溶液短暂洗涤，以除去血小板，细胞分离介质和血浆，就可以分离单个核细胞。通常情况下，分离所得的细胞中95±5%为单个核细胞，细胞存活率＞90%，回收率为60±20%。

组分	规格
淋巴细胞分离液1.084	100mL
说明书	1份

保存：室温，避光，有效期3年。

• 稀释去纤维蛋白血液或肝素化血液用的盐溶液为无菌液体。
  
• 为保持淋巴细胞的活性，应该采血后尽快进行分离。分离细胞层实际上是单个核细胞层，包括淋巴细胞和单核细胞。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；
  
• 本制品仅作科研用途！

• 材料准备
  
  • 样本体积(4mL总体积)：取2mL的去纤维蛋白或抗凝血，将其与等体积(2mL)的无菌盐溶液以1：1比例混合。注：大体积的血样可以得到相同的分离效率，只需要选用更大直径的离心管，以维持血样的高度(约3cm)和LSM-1.084溶液的高度(约2.4cm)。
    
  • LSM-1.084分离液，使用前需放到室温环境下温度平衡10～30min；
    
  • 平衡盐溶液：用做稀释和清洗液，建议直接购买商业化的盐溶液。也可以使用其他溶液，如不含Ca²⁺/Mg²⁺的磷酸盐溶液(如DPBS溶液)，Hank’s，或者细胞培养液(如RPMI 1640)。
• 分离单个核细胞
  
  • 取2mL的去纤维蛋白或抗凝血，将其与等体积(2mL)的无菌盐溶液以1：1比例混合，于10～15mL离心管中颠倒混匀，或用枪上下轻轻吹打数次以至混匀。
    注：肝素、EDTA、柠檬酸钠、ACD、CPD抗凝皆可。去纤维蛋白血不需要抗凝剂。
    
  • 使用前轻轻颠倒瓶子使LSM-1.084充分混合，用注射器或枪头无菌条件转移3mL LSM到10～15mL离心管中。
    
  • 小心将稀释血液加入3mL LSM-1.084(室温即可)的上层，使得在血液和LSM间形成一个明显的分层。不要将稀释血液混入LSM-1.084中，如图1。
    
    图1.加样后分层示意图
    
  • 室温下400×g离心30～40min，离心可以沉淀红细胞和多形核白细胞，同时可以在LSM-1.084上形成一层单核-淋巴细胞分层，如图2所示(从上到下，依次分为血浆层-单个核细胞层-LSM-1.084层-粒细胞-红细胞)。
    
  • 用无菌枪头吸掉单个核细胞层(含淋巴细胞和单核细胞)上方2～3mm的血小板/血浆，小心操作勿吸入单个核细胞层内破坏其平衡(如图2)。
    注：也可以不用先吸走血浆层，直接用枪吸取单个核细胞层。另外，上层血浆不含细胞，也可以留作他用。
    
    图2.吸除上层血浆和血小板前后分层示意图
    
  • 用无菌枪头将单核细胞层转移入一个新的无菌离心管。
    注：一定要吸取所有的单个核细胞中间层，以及少量上方的血浆液和下方的LSM-1.084分离液。
    
  • 预估转移后的单个核细胞量，加入至少3倍体积(约6mL)的平衡盐溶液于上述离心管中。
    
  • 使用枪头上下轻轻吹打将单层细胞溶液充分悬浮。
    
  • 室温400～500×g离心10～15min。
    注：高速离心有助于提高单个核细胞的回收率，但如果需要彻底去除血小板，则推荐低速离心(60～100×g)。
    
  • 去除上清，加入6～8mL平衡盐溶液重悬单核细胞。
    
  • 室温400～500×g(或者60～100×g去除血小板)离心10min。
    
  • 去除上清，用适当培养基重悬单个核细胞备用。
• 分离粒细胞
  1．同上方单个核细胞的分离步骤1～6。
  
  7. 小心吸除LSM-1.084层，注意切勿吸入粒细胞层。
     
  8. 转移暴露在表面的白色粒细胞层(位于红细胞层上方)于一个无菌的50mL离心管。
     
  9. 加入至少5倍体积的平衡盐溶液重悬粒细胞，于400×g离心15min。
     
  10. 吸除上清，加入6～8mL平衡盐缓溶液重悬粒细胞，于室温400～500×g离心10min。
      
  11. 吸除上清，用适当培养液重悬粒细胞备用。

影响单个核细胞分离效果的因素

• 血液样品保存时间
  血液尽可能新鲜且无血块，为获得最佳分离效果，最好在取血2h内进行实验。血液放置过久可能会降低细胞存活率、回收率，甚至有可能引入粒细胞和红细胞污染，放置超过6h可能会严重影响分离效果。
  
• 血液体积
  血液量和管径决定样本在管子中的高度，以及后续的离心时间。提高离心管内的血液高度会引入红细胞污染的可能。但是分离效率不会明显受管径的影响。因此，对于体积大的血样，建议可在保持离心时间不变的情况下选择更大直径的离心管。
  
• 红细胞去除
  单个核细胞分离的产量和纯度与红细胞是否去除干净有关。
  若全血中红细胞发生凝集会导致一些单个核细胞也被聚集在内，从而在离心后被沉降在红细胞层内。可通过稀释全血的方法来避免此现象。温度大小会影响红细胞的凝集，18℃条件能提供最佳的分离效果。若温度升高(如37℃)会提高红细胞凝集的可能，降低分离效果。低温(4℃)环境红细胞聚集可能降低，需要增加离心时间。提高离心时间到5～10min能减低红细胞污染。
  
• 血小板污染
  对于血小板要求较为严格的分离实验，使用4～20%的蔗糖梯度层加在LSM-1.084溶液层上方，再次离心以去除所有的血小板。离心后，血小板分布在蔗糖溶液上方，单个核细胞穿过蔗糖溶液停留在LSM-1.084溶液上方。

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